碧云天研发的冠状病毒Mpro/3CLpro活性荧光检测试剂盒(Coronavirus Mpro/3CLpro Activity Fluorometric Assay Kit)是一种用荧光法快速高灵敏检测冠状病毒主蛋白酶(main protease, 简称Mpro，也称3C-like protease，简称3CLpro)活性的试剂盒。
2019年底由新型冠状病毒引起的肺炎疫情，从2020年初开始在全球大流行，感染病例快速上升，引发全球关注。该病毒被世界卫生组织(WHO)命名为2019-nCoV，被国际病毒分类委员会命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。由新型冠状病毒导致的疾病，被世界卫生组织正式命名为冠状病毒疾病2019 (Corona Virus Disease 2019, COVID-19），通常称为新型冠状病毒肺炎，简称“新冠肺炎”。
新型冠状病毒(2019-nCoV)属于单正链的RNA病毒，与SARS-CoV以及MERS-CoV具有较高的同源性，该病毒感染进入宿主细胞后，在宿主细胞的帮助下，其遗传物质RNA的ORF1a/b首先翻译表达出两条多聚蛋白前体(pp1a和pp1ab)，多聚蛋白前体在主蛋白酶(main protease, 简称Mpro)和木瓜样蛋白酶(papain like proteases)的作用下发生分子内的切割产生多个非结构蛋白。Mpro也被称为3C-like protease (3CLpro)，因为其切割位点的特异性与微小RNA病毒(picornavirus)的3C蛋白酶(3C protease)很相似，两者并称为Mpro/3CLpro。多聚蛋白前体产生的非结构蛋白参与了病毒亚基因RNA和四个结构蛋白(envelope/E蛋白、membrane/M蛋白、spike/S蛋白和nucleocapsid/N蛋白)的产生，进而完成子代病毒的繁衍与释放。由于Mpro蛋白酶在病毒的生命周期中起到了至关重要的作用，且人体内没有同源蛋白，故Mpro主蛋白酶是一个抗病毒药物研发的理想靶点。
2019-nCoV Mpro/3CLpro与SARS-CoV Mpro/3CLpro只差12个氨基酸，同源性大于96%，两者结构基本一致，本试剂盒中使用的阳性对照2019-nCoV Mpro/3CLpro是碧云天采用自主研发的PerfectProtein™蛋白表达技术平台纯化而来，使表达的重组2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白没有任何额外的标签，没有任何一个额外的氨基酸，确保与2019-nCoV病毒的Mpro/3CLpro氨基酸序列完全一致，便于检测体系的建立和酶活的比较。
冠状病毒Mpro/3CLpro活性检测试剂盒采用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其检测原理如下。MCA是荧光供体(Donor)，Dnp是荧光受体(Acceptor)或称为淬灭基团(Quencher)，这两个荧光基团的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般7-10nm)，荧光能量由供体向受体转移，导致供体荧光分子自身的荧光强度衰减。MCA和Dnp被连接到Mpro/3CLpro蛋白酶的天然底物(Substrate)，即MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2 (P9731)的两端。当Mpro/3CLpro蛋白酶没有切割该底物时，两个基团足够接近，发生荧光共振能量转移，即Dnp可淬灭MCA荧光而检测不到荧光；当该底物被Mpro/3CLpro蛋白酶切割后，多肽的首尾两端分离，两个基团分开，MCA荧光不再被Dnp淬灭，即可检测到MCA荧光，这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测Mpro/3CLpro蛋白酶的酶活性。MCA的最大激发波长为325nm，最大发射波长为393nm。本试剂盒的检测原理请参考图1。
图1. 碧云天冠状病毒Mpro/3CLpro活性荧光检测试剂盒检测原理图。
本试剂盒内提供了MCA标准溶液，MCA标准品在0.2-50μM范围内有良好的线性关系。可以通过设置标准曲线，计算出样品中Mpro/3CLpro蛋白酶的活性。
本试剂盒可以检测不同类型样本的冠状病毒Mpro/3CLpro酶活力，包括新冠病毒、含新冠病毒的细胞或动物组织、表达Mpro/3CLpro酶的细胞或组织裂解液或纯化的Mpro/3CLpro酶等。
用于96孔板检测时，本试剂盒小包装P0313S可以进行100次检测，本试剂盒中包装P0313M可以进行500次检测。
包装清单：
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产品编号
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产品名称
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包装
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P0313S-1
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Assay Buffer
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20ml
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P0313S-2
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2019-nCoV Mpro/3CLpro (1mg/ml)
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10μl
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P0313S-3
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Substrate
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400μl
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P0312S-4
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MCA Standard (10mM)
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20μl
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说明书
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1份
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产品编号
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产品名称
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包装
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P0313M-1
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Assay Buffer
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100ml
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P0313M-2
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2019-nCoV Mpro/3CLpro (1mg/ml)
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20μl
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P0313M-3
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Substrate
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2ml
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P0312M-4
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MCA Standard (10mM)
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100μl
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说明书
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1份
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保存条件：
-20℃保存，一年有效。其中P0313-3 Substrate和P0313-4 MCA Standard (10mM)需避光保存。
注意事项：
本产品不同批号的本产品可能存在Substrate的提供量和使用量不同的问题，请注意按照说明书进行相应操作。
Assay Buffer、Substrate和MCA Standard (10mM)需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则可能会影响检测结果。2019-nCoV Mpro/3CLpro (1mg/ml)的使用应在冰上进行。使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。
请确保样品pH值在7-8之间，或加入样品后反应体系的pH值在7-8之间，否则可能会影响检测结果的信号值和稳定性。
待测样品裂解液是指裂解和稀释待测样品所用的裂解液，即病毒裂解液或含病毒的细胞、组织裂解液的稀释液，该溶液可能会对检测产生干扰，推荐用本试剂盒提供的Assay Buffer为溶剂稀释待测样品。体积较少的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。
检测时建议使用96孔黑板，推荐选购碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
