碧云天研发的Avi标签蛋白生物素标记试剂盒(BirA法)(Biotin Labeling Kit for Avi-tag Protein with BirA)是一种通过生物素连接酶(BirA)对Avi标签融合蛋白或多肽快捷、高效地进行生物素标记的试剂盒。生物素标记的蛋白可使用基于Streptavidin或Avidin方法进行纯化或检测，例如使用Streptavidin磁珠对生物素标记蛋白进行纯化，或用HRP等标记的Streptavidin对生物素标记蛋白进行检测。
本试剂盒中的生物素连接酶(Biotin-protein ligase, BirA)来源于E.coli，由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的重组蛋白，纯度高，活性强，没有额外的标签，不影响生物素标记蛋白的后续检测和纯化。BirA可在ATP存在的条件下，高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5’腺苷酸，并特异性地将生物素连接到Avi标签的赖氨酸残基上，从而对目的蛋白进行快捷、高效的生物素标记(图1)。
图1. 碧云天Avi标签蛋白生物素标记试剂盒(BirA法)的原理图。
Avi标签是由15个氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)组成的短肽标签，在ATP和生物素存在的条件下，BirA在Avi标签的赖氨酸残基上连接一个生物素，从而实现目的蛋白的生物素标记[1]。生物素连接酶BirA特异性的生物素标记Avi标签有多方面的优点。Avi标签小且对融合蛋白的影响非常小，只针对Avi标签上的Lys残基进行特定位置的生物素标记，生物素标记效率高，可重复性好；体内或体外均可进行标记，标记后的蛋白与链霉亲和素(Streptavidin)的亲和力高，从而使Avi-tag技术可以应用于目的蛋白的固定吸附、纯化和检测等；相比于传统生物素化学标记的非特异性位点的标记，BirA催化的反应条件更温和、更简单，对被标记蛋白活力影响小，酶活效率高，标记特异性强[1]。
生物素(Biotin)与亲和素(Avidin)或链霉亲和素(Streptavidin)之间的非共价相互作用是已知的几乎是最强的蛋白-配体的相互作用[2]。Avidin或Streptavidin是一种4聚体蛋白，可以同时高度特异性地结合4个生物素分子，是一种天然存在的生物分子相互作用体系。生物素与Avidin或Streptavidin的结合系统，被称为生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素系统，该系统是一种具有高度亲和力、高灵敏度、特异性强和稳定性好等优点的信号放大标记技术，已广泛应用于多种检测系统[3]。
本试剂盒用于体外生物素标记Avi标签融合蛋白的效果参考图2。
图2. 碧云天的Avi标签蛋白生物素标记试剂盒(BirA法)进行体外生物素标记Avi标签融合蛋白的效果图。在50μl反应体系中，加入相同量带有Avi标签的蛋白，及一定浓度的生物素连接酶(BirA)，30℃孵育30分钟，反应完毕后加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) (P0015)，使用BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Hepes, 4-15%, 10孔) (P0519)电泳。一份样品进行Western，使用辣根过氧化物酶标记Streptavidin (A0303)孵育，检测Avi标签融合蛋白被生物素标记的效率(上图)，Western印迹成像由BeyoImager™ 600化学发光成像系统(EI600)完成；另一份样品作为Input，使用BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液(P0017F)对Avi标签融合蛋白进行染色(下图)。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
用于体外Avi标签蛋白的生物素标记反应时，按照20μl或50μl反应体系，蛋白(多肽)终浓度40μM计算，本产品小包装可以用于50或20个样品的标记，中包装可以用于250个或100个样品的标记，大包装可以用于1250个或500个样品的标记。
包装清单：
| 产品编号 |
产品名称 |
包装 |
| P0630S-1 |
BirA (100X) |
10μl |
| P0630S-2 |
Biotin Ligase Buffer A (10X) |
100μl |
| P0630S-3 |
Biotin Ligase Buffer B (10X) |
100μl |
| — |
说明书 |
1份 |
| 产品编号 |
产品名称 |
包装 |
| P0630M-1 |
BirA (100X) |
50μl |
| P0630M-2 |
Biotin Ligase Buffer A (10X) |
0.5ml |
| P0630M-3 |
Biotin Ligase Buffer B (10X) |
0.5ml |
| — |
说明书 |
1份 |
| 产品编号 |
产品名称 |
包装 |
| P0630L-1 |
BirA (100X) |
250μl |
| P0630L-2 |
Biotin Ligase Buffer A (10X) |
2.5ml |
| P0630L-3 |
Biotin Ligase Buffer B (10X) |
2.5ml |
| — |
说明书 |
1份 |
保存条件：
-20℃保存，一年有效。
注意事项：
建议首次解冻Biotin Ligase Buffer B (10X)后进行分装，反复冻融会影响组分活性。
BirA的用量、反应温度和时间等可根据不同实验预先进行适当摸索和优化，例如BirA的浓度可在0.2X-2X之间适当调整。
本产品的蛋白(多肽)底物为带有Avi标签的融合蛋白或多肽，碧云天提供一系列Avi标签的原核表达质粒：pET-N-His-Avi (D3002)，pET-His-MCS-Avi (D3005)，pET-N-Avi-His-SUMO3 (D3007)，D3009 pET-N-His-SUMO3-Avi (D3009)；真核表达质粒pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo (D2973)，pCMV-N-3X Flag-Avi-SUMOEU1-Neo (D2975)，pCMV-N-3X Flag-SUMOEU1-MCS-Avi (D2979)。
反应溶液中的盐或试剂的终浓度有一定要求，如NaCl < 100mM，Glycerol < 5%，(NH4)2SO4 < 50mM，Tris < 50mM，否则会抑制生物素连接酶的活性。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
