产品使用信息

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保存在 10mM sodium HEPES（pH 为 7.5）、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析，在 4°C 下，将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育，轻晃孵育一整夜。

注意：请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测，蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。

2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。

3. 1X SDS 上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。

4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。

5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。

6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。

7. 脱脂奶粉：(#9999)。

8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。

9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。

10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。

11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。

12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。

13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。

14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。

15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。

16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。

2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。

3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。

4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。

5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。

6. 微量离心机内离心 5 分钟。

7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

   注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。

2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。

3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。

4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。

2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。

3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

特异性/敏感性

14-3-3 β/α Antibody 可检测14-3-3 β/α 总蛋白的内源水平。

物种反应性：

人, 小鼠, 大鼠, 猴

来源/纯化

使用与人 14-3-3 β/α 序列相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白质 A 和肽亲和色谱对抗体进行纯化。

背景

14-3-3 家族蛋白在信号转导、检查点控制、凋亡和营养感应通道 (1,2) 中起到关键调节作用。14-3-3 蛋白高度保守且表达广泛。已经在哺乳动物内发现了至少 7 个亚型 β、γ、ε、σ、ζ、τ 和 η。最初发现的 α 和 δ 亚型已经证明分别是 β 和 ζ 亚型的磷酸化形式 (3)。通过它们的氨基末端 α 螺旋区域，14-3-3 蛋白可形成同源或异源二聚体，这些二聚体与包括转录因子、新陈代谢酶、细胞支架蛋白、激酶、磷酸化酶在内的很多蛋白质和其它信号分子发生相互作用 (3,4)。14-3-3 蛋白和其他靶标蛋白间的相互作用主要是通过一个磷酸化的丝氨酸/苏氨酸基序完成的。但是，据观察该蛋白也能够和不同的磷酸化丝氨酸/苏氨酸基序结合，以及呈现磷酸化非依赖性的相互作用 (4)。14-3-3 的结合会遮蔽掉靶标蛋白的特殊序列进而影响靶标蛋白的定位，磷酸化状态，稳定性和分子间相互作用 (1-4)。14-3-3 蛋白也可诱导靶标蛋白的构象变化以影响靶标蛋白的功能 (4,5)。在发育和应对细胞外信号和药物的急性反应期发现了不同 14-3-3 蛋白亚型的时空表达模式，表明尽管 14-3-3 蛋白亚型的序列相似，它们可能具有不同的功能 (4)。若干研究表明 14-3-3 亚型在癌症和神经性疾病中受到不同的调控 (2,3)。