pShuttle-CMV-N-EFGP (腺病毒质粒, 绿色荧光)是碧云天自行研发的用于构建表达N端EGFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白的重组腺病毒包装用的穿梭质粒。本穿梭质粒构建后，需要和预转染了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)以及重组腺病毒包装细胞配合使用才能完成重组腺病毒的包装。

pShuttle-CMV-N-EFGP质粒可以用于在包装成腺病毒后表达N端含EGFP(Enhanced GreenFluorescent Protein, 增强绿色荧光蛋白)标签的融合蛋白。该质粒含有CMV启动子，可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达。在多克隆位点的前面有一个EGFP的完整编码序列，因此在多克隆位点根据阅读框插入目的基因就可以表达N端含有EGFP标签的融合蛋白。利用EGFP的荧光特性可以比较容易地观察融合蛋白的表达水平和细胞内定位，也可以利用GFP抗体来检测或免疫沉淀融合蛋白。

本质粒为卡那霉素抗性。

重组腺病毒(Recombinant adenoviruses)是一种常见的用于在培养细胞或动物体内表达外源基因的重要工具。重组腺病毒具有感染宿主细胞范围广、感染不依赖细胞分裂、高滴度及目的基因表达水平高等特性。最常用的腺病毒载体是人类血清5型腺病毒。改造后的人类血清5型腺病毒，删除了在病毒装配过程中起关键作用的E1基因和非必须的能表达逃避宿主免疫的E3基因，E1和E3基因的删除使得重组腺病毒不能自我复制，同时给外源基因的插入提供了空间，最长可插入7.5kb的外源基因。从而提高了重组腺病毒的的安全性和可操作性。重组腺病毒的包装细胞，例如AD-293、293A、HEK293等细胞中，表达E1基因，这样就可以在这些包装细胞中正常装配重组腺病毒了。

pShuttle系列的穿梭质粒携带外源目的基因，经过Pme I线性化，随后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(D8106)共转染到大肠杆菌BJ5183中，或者转染到已经已经预转染了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)中同源重组。BJ5183菌株表达recET基因，具有很高的基因同源重组(homologous recombination)活性，使带有目的基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1通过末端反向重复序列同源重组，实现外源基因与腺病毒基因组的整合。将重组的携带外源基因的腺病毒质粒用Pac I线性化后转染到AD-293、293A、HEK293等重组腺病毒包装细胞中进行包装。从而制备获得高滴度、自我复制缺陷并且带有目的基因的重组腺病毒。

目的基因引入时不能含有Pme I及Pac I这两个酶切位点，如果含有该两个酶切位点的目的基因，需要对该位点进行突变方可进行基因操作。

pShuttle-CMV-N-EGFP 主要信息如下：

pShuttle-CMV-N-EGFP 质粒(8195bp)的图谱如下：

pShuttle-CMV-N-EGFP质粒的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D8129 pShuttle-CMV-N-EGFP.pdf。

pShuttle-CMV-N-EGFP 中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pShuttle-CMV-N-EGFP)包括：

pShuttle-CMV-N-EGFP 中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pShuttle-CMV-N-EGFP once)包括：

pShuttle-CMV-N-EGFP 质粒中推荐使用的测序引物序列如下：

forward primer (888-907): 5´GGTCTATATAAGCAGAGCTG3´

Reverse primer (1732-1754): 5´GTGGTATGGCTGATTATGATCAG 3´

pShuttle-CMV-N-EGFP的全序列信息:pShuttle-CMV-N-EGFP序列.txt。

腺病毒包装的具体方法和步骤可以参考如下网页:

https://www.beyotime.com/support/pShuttle.htm

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本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。