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碧云天 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo(慢病毒质粒)(D8301-1μg)

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    D8301-1μg
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  • 商品名称:碧云天 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo(慢病毒质粒)(D8301-1μg)
  • 商品编号:D8301-1μg
  • 品牌:碧云天
  • 上架时间:2022-08-11
  • 商品毛重:200.100千克
  • 库存: 65535
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D8301-1μg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo 1μg 888.00元
D8301-100μg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo 100μg 1169.00元

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo是碧云天自行研发的用于方便地插入靶向目的基因的sgRNA (Single guide RNA)并使用CRISPR/Cas9基因编辑(Gene editing)系统进行基因编辑的质粒。本质粒表达绿色荧光蛋白EGFP (Enhanced green fluorescent protein)便于观察转染效率或感染效果,同时携带了Neo抗性(G418抗性),方便后续进行多克隆或单克隆稳定细胞株的筛选。本质粒在插入靶向目的基因的sgRNA后,可以直接转染细胞进行基因编辑,也可以用于包装慢病毒后感染细胞或组织进行基因编辑。

慢病毒(Lentivirus)是以HIV-1 (人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的病毒载体系统。它能高效地将目的基因(蛋白质编码序列或小RNA)导入动物或人的原代细胞或细胞系。慢病毒的宿主范围广,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达,被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中[1-3]。本慢病毒载体进行了多方面的改造,删除了慢病毒绝大部分的致病基因,并使包装后的病毒失去了自我复制能力,安全性大大提升,并能有效提高外源基因的表达效果。本质粒可以和pCMV-VSV-G (D8215)以及pCAG-dR8.9 (D8216)配合使用进行慢病毒的包装。

本质粒经过BsmBⅠ (CGTCTC(1/5)^)限制性核酸内切酶消化后,切除图谱中标示的filler,把设计好的靶向特定基因的sgRNA序列经退火后形成的双链寡核苷酸片段连接到载体中,就能构建成相应的用于基因编辑的质粒了。

本质粒中使用了人源化脓性链球菌Cas9 (Humanized S. pyogenes Cas9, hSpCas9)。hSpCas9是一种能在sgRNA的引导下切割双链DNA的核酸内切酶。在sgRNA的引导下,Cas9剪切基因靶位点产生双链DNA断裂,随后在细胞DNA修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换,从而可能产生移码突变,导致目的基因的缺失突变。当设计的sgRNA的基因靶位点相对比较靠近5'端的时候,就能导致通常所说的基因敲除。本质粒中在hSpCas9的C端添加了核定位信号(Nuclear localization signal, NLS),能够有效确保hSpCas9定位在细胞核,从而有效提高基因编辑效率。

本质粒表达的Cas9带有Flag标签,可通过Flag抗体(AF0036/AF5051/AF519)检测Cas9的表达。同时本质粒中Cas9-Flag和EGFP之间通过P2A连接。EGFP与Cas9-Flag同时翻译,可以呈现很强的绿色荧光,可以在荧光显微镜下非常便捷地观察到本质粒的表达情况(图1),并且也方便使用流式细胞仪分选阳性细胞。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游Cas-Flag的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率。

图1.碧云天pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。

本质粒含有卡那霉素(Kanamycin)和新霉素(Neomycin)抗性。在大肠杆菌中呈现卡那霉素抗性。本质粒转染哺乳动物细胞后,可使用G418 (ST081)筛选多克隆或单克隆细胞株。

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV promoter 1-199
5' LTR (truncated) 217-397
HIV-1 Ψ 444-569
RRE 1062-1295
cPPT/CTS 1822-1939
U6 promoter 1990-2230
filler 2235-4119
gRNA scaffold 4120-4195
EF-1α core promoter 4257-4468
Kozak sequence 4487-4496
Cas9 4493-8596
nucleoplasmin NLS 8597-8644
FLAG 8645-8668
P2A 8678-8734
EGFP 8735-9454
WPRE 9470-10058
Factor Xa site 9941-9952
3' LTR (ΔU3) 10130-10363
bGH poly(A) signal 10395-10619
f1 ori 10665-11093
SV40 promoter 11107-11436
SV40 ori 11287-11422
EM7 promoter 11484-11531
NeoR/KanR 11550-12344
SV40 poly(A) signal 12474-12595
M13 rev 12644-12660
lac operator 12668-12684
lac promoter 12692-12722
CAP binding site 12737-12758
ori 13046-13634
CMV enhancer 14104-14483

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo质粒(14484bp)的图谱如下:

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D8301 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo.pdf

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AscI AsiSI AxyI BoxI BpvUI
Bse21I BsiWI BstEII BstHPI BstPI BstPAI Bsu36I
Eco81I Eco91I EcoO65I FseI FspAI HpaI I-CeuI
I-PpoI I-SceI KspAI MauBI MreI PaeR7I PalAI
Pfl23II PI-PspI PI-SceI Ple19I PshAI PspEI PspLI
PspXI PvuI RgaI RigI SbfI SdaI SfaAI
SfiI Sfr274I SgfI SgrAI SgrDI SgsI SlaI
SrfI Sse8387I XhoI

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo中的单酶切位点包括:

Acc65I G`GTAC,C 1984 NotI GC`GGCC,GC 907
AfeI AGC|GCT 4483 NruI TCG|CGA 596
AgeI A`CCGG,T 4470 PacI TTA,AT`TAA 1980
AvrII C`CTAG,G 11421 PasI CC`CWG,GG 6262
BamHI G`GATC,C 8669 PflFI GACN`N,NGTC 11796
BbvCI CC`TCA,GC 1183 PmeI GTTT|AAAC 10373
BmtI G,CTAG`C 4212 RsrII CG`GWC,CG 12194
BspDI AT`CG,AT 3277 SacII CC,GC`GG 9973
BsrGI T`GTAC,A 9444 SexAI A`CCWGG,T 11188
BssHII G`CGCG,C 474 SmaI CCC|GGG 11444
BstBI TT`CG,AA 2849 SnaBI TAC|GTA 14459
BstZ17I GTA|TAC 12606 SpeI A`CTAG,T 14118
ClaI AT`CG,AT 3277 StuI AGG|CCT 11420
EcoRI G`AATT,C 4202 SwaI ATTT|AAAT 3632
EcoRV GAT|ATC 6346 TspMI C`CCGG,G 11442
KpnI G,GTAC`C 1988 Tth111I GACN`N,NGTC 11796
MluI A`CGCG,T 9455 XbaI T`CTAG,A 4476
NheI G`CTAG,C 4208 XmaI C`CCGG,G 11442

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo质粒可使用的测序引物序列如下:

sgRNA的测序引物hU6-F primer: 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo的全序列信息:D8301 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D8301-1μg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo 1μg
D8301-100μg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo 100μg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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