pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro是碧云天自行研发的用于方便地插入靶向目的基因的sgRNA (Single guide RNA)并使用CRISPR/Cas9基因编辑(Gene editing)系统进行基因编辑的质粒。本质粒表达绿色荧光蛋白EGFP (Enhanced green fluorescent protein)便于观察转染效率或感染效果，同时携带了Hygro抗性，方便后续进行多克隆或单克隆稳定细胞株的筛选。本质粒在插入靶向目的基因的sgRNA后，可以直接转染细胞进行基因编辑，也可以用于包装慢病毒后感染细胞或组织进行基因编辑。

慢病毒(Lentivirus)是以HIV-1 (人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的病毒载体系统。它能高效地将目的基因(蛋白质编码序列或小RNA)导入动物或人的原代细胞或细胞系。慢病毒的宿主范围广，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达，被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中[1-3]。本慢病毒载体进行了多方面的改造，删除了慢病毒绝大部分的致病基因，并使包装后的病毒失去了自我复制能力，安全性大大提升，并能有效提高外源基因的表达效果。本质粒可以和pCMV-VSV-G (D8215)以及pCAG-dR8.9 (D8216)配合使用进行慢病毒的包装。

本质粒经过BsmBⅠ (CGTCTC(1/5)^)限制性核酸内切酶消化后，切除图谱中标示的filler，把设计好的靶向特定基因的sgRNA序列经退火后形成的双链寡核苷酸片段连接到载体中，就能构建成相应的用于基因编辑的质粒了。

本质粒中使用了人源化脓性链球菌Cas9 (Humanized S. pyogenes Cas9, hSpCas9)。hSpCas9是一种能在sgRNA的引导下切割双链DNA的核酸内切酶。在sgRNA的引导下，Cas9剪切基因靶位点产生双链DNA断裂，随后在细胞DNA修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换，从而可能产生移码突变，导致目的基因的缺失突变。当设计的sgRNA的基因靶位点相对比较靠近5'端的时候，就能导致通常所说的基因敲除。本质粒中在hSpCas9的C端添加了核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)，能够有效确保hSpCas9定位在细胞核，从而有效提高基因编辑效率。

本质粒表达的Cas9带有Flag标签，可通过Flag抗体(AF0036/AF5051/AF519)检测Cas9的表达。同时本质粒中Cas9-Flag和EGFP之间通过P2A连接。EGFP与Cas9-Flag同时翻译，可以呈现很强的绿色荧光，可以在荧光显微镜下非常便捷地观察到本质粒的表达情况(图1)，并且也方便使用流式细胞仪分选阳性细胞。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游Cas-Flag的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率。

图1.碧云天pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和潮霉素B (Hygromycin B)抗性。在大肠杆菌中呈现氨苄青霉素抗性。本质粒转染哺乳动物细胞后，可使用Hygromycin B (潮霉素B) (ST1389)筛选多克隆或单克隆细胞株。

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro质粒的主要信息如下：

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro质粒(15647bp)的图谱如下：

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D8309 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro.pdf

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro中没有的酶切位点包括：

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro中的单酶切位点包括：

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro质粒可使用的测序引物序列如下：

sgRNA的测序引物hU6-F primer: 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro的全序列信息:D8309 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro序列.txt

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