pCMV-EGFP-p65是碧云天自行研发生产的在哺乳动物细胞中表达EGFP标签的p65融合蛋白的质粒。该质粒含有CMV启动子，带有卡那霉素(Kanamycin)抗性，可以使用G418 (ST081)筛选稳定表达融合蛋白的细胞株，是研究NF-κB信号通路的激活和抑制的有效工具。本产品主要适合用于通过荧光显微镜等活细胞观察NF-κB的核转运激活。

NF-κB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)，中文名为激活的B细胞核因子kappa-轻链增强子，是细胞内重要的核转录因子，参与细胞对外界刺激的响应、炎症反应、免疫应答等过程，几乎存在于所有类型的动物细胞中。NF-κΒ作为转录因子蛋白家族，包括5个亚单位：p50 (NF-κB1)、p52 (NF-κB2)、p65 (REL-associated protein, Rel-A)、Rel-B和c-Rel，它们的N端都具有高度保守的RHD (REL homology domain)；5个亚单位根据C端结构域的不同被分为两类，第一类为p50、p52，其C端具有ankyrin重复结构域具有转录抑制活性(Transrepression activity)和招募IKK (Inhibitory κB kinase)的致死结构域(Dead domain)；第二类为p65、Rel-B和c-Rel，其C端具有转录所必需的转录激活结构域(Transactivation domain, TAD)[1]。

NF-κB在静息状态或失活状态(Resting state or inactive state)下，其高度保守的RHD中的核定位信号(Nuclear localization sequence, NLS)与抑制因子IκB (Inhibitor of NF-κB)结合形成非活性复合物，NF-κB以失活状态存在于细胞质中。虽然IκB蛋白掩盖了p65的NLS信号，但没有掩盖p50的NLS信号，因此静息状态下NF-κB可以持续在细胞核和细胞质之间穿梭(Shuttle)维持很低水平的活性[2]。

NF-κB的激活存在两条途径，即经典途径和非经典途径。经典途径：在受到促炎信号(如炎症细胞因子TNF-α、IL-1、病原体和病毒双链RNA等)的刺激后，使细胞中的IKK复合物被招募并激活，IKK复合物由IKKα和/或IKKβ催化亚基以及NEMO (NF-κB Essential Modulator，亦称IKKγ)组成，IKK复合物使IκB被磷酸化，磷酸化的IκB随后发生泛素化被蛋白酶体降解，使得NF-κB的核定位信号暴露从而进入细胞核激活靶基因；非经典途径：该途径由NF-κB抑制激酶NIK (NF-κB inhibitory kinase)介导，NIK磷酸化并激活IKK的亚基IKKα，磷酸化的IKKα再使p100磷酸化，导致加工和释放有活性的p52和RelB异源二聚体转移至细胞核并激活靶标基因，这一过程发生在淋巴器官发育期间，淋巴器官负责产生B淋巴细胞和T淋巴细胞[2]。

pCMV-EGFP-p65转染细胞后通过荧光显微镜观察，静息状态下EGFP-p65均匀的分布在细胞质中，NF-κB被激活后EGFP-p65转移到细胞核内。本产品转染HEK293T细胞的效果如图1所示。

图1.碧云天pCMV-EGFP-p65质粒转染HEK293T细胞效果图。pCMV-EGFP-p65质粒转染HEK293T细胞48小时后，经荧光显微镜观察，静息状态(Inactive state)下，EGFP-p65均匀分布在细胞质中。加入TNF-α (P6231)刺激HEK293T细胞后，激活状态(Active state)下，EGFP-p65进入细胞核内。实际荧光强度会因实验仪器、检测条件的不同而存在差异，本图仅供参考。

pCMV-EGFP-p65质粒的主要信息如下：

pCMV-EGFP-p65质粒(6378bp)的图谱如下：

pCMV-EGFP-p65质粒的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D2820 pCMV-EGFP-p65.pdf

pCMV-EGFP-p65中没有的酶切位点包括：

pCMV-EGFP-p65中的单酶切位点包括：

pCMV-EGFP-p65质粒中推荐使用的测序引物序列如下：

CMV-F primer (519-539): 5' -CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'

EGFP-C-5 primer (1266-1287): 5' -CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3'

SV40pA-R primer (3222-3203): 5' -GAAATTTGTGATGCTATTGC-3'

pCMV-EGFP-p65的全序列信息:D2820 pCMV-EGFP-p65全序列信息.txt

-20℃保存。

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。