超快速DNA连接试剂盒(Instant DNA Ligation Kit)，也被称为瞬时DNA连接试剂盒或即时DNA连接试剂盒，是碧云天研发的一种把粘末端或平末端DNA片段在室温(20-25℃)短至0-1分钟内快速插入到载体(Vector)中的连接试剂盒。同时本试剂盒也可以用于其它各种常规的双链DNA连接反应。

本试剂盒可以用于PCR片段和载体的连接、酶切产物和载体的连接、linker和载体的连接、linker和linker的连接等各种双链DNA的连接。

为了获得快速高效的连接效果，本试剂盒采用了一种特殊的高活力Instant T4 DNA Ligase以及相应的Instant Ligation Buffer。通常连接0-1分钟和连接60min的效果相近。本试剂盒用于双平端片段插入到pUC18载体的连接，后续转化DH5α感受态细胞后涂板获得的LB平板的实测效果参考图1A，菌落PCR鉴定结果参考图1B。

图1. 碧云天超快速DNA连接试剂盒(D7001)用于平末端DNA连接的效果图。本试剂盒用于平末端片段插入到载体的连接，随后转化涂板的效果见图A。在20µl反应体系中，将SmaI单酶切线性化并用D7028 Antarctic Phosphatase (Thermosensitive)去除末端磷酸根的载体pUC18与PCR扩增的1100bp双平端DNA片段混合(载体与DNA片段的摩尔比为1:3)，然后加入4µl的5X Instant Ligation Buffer，1µl Instant T4 DNA Ligase，并用水补足至20µl，室温反应0min、1min、5min、60min。然后取10µl转化到100µl的DH5α感受态细胞中，随后涂板。如图所示，连接0、1、5或60min后转化后得到的克隆数相近。菌落PCR鉴定使用本试剂盒连接获得的克隆效果见图B。菌落PCR引物为M13 forward sequencing primer (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3')和M13 reverse sequencing primer (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')。如图所示，0min连接阳性率可达100%，连接时间越长，阳性率略有减少趋势，连接60min后，阳性率达60%。实际检测效果会因实验条件的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

在确保连接效果的同时，确保完成连接后不必进行任何纯化即可直接转化细菌。另外，Instant Ligation Buffer中已经含有ATP、镁离子等各种必需物质，无需再添加其它任何试剂。

本试剂盒用于总体积为10µl的连接体系时，小包装和中包装分别可以进行100个和500个连接反应；用于总体积为20µl的连接体系时，小包装和中包装分别可以进行50个和250个连接反应。

-20℃保存，至少一年有效。

连接反应完成后即可直接转化细菌，请勿加热失活Instant T4 DNA Ligase。加热处理会导致后续的转化效率显著下降。

对于载体单酶切插入外源片段的情况，需注意对载体使用磷酸酶，如D7028 Antarctic Phosphatase (Thermosensitive)或D7027 BeyoAP Alkaline Phosphatase进行脱磷处理，以避免质粒自连。

Instant Ligation Buffer (5X)使用前一定要完全溶解并混匀，加入到连接体系后也须注意混匀。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。