碧云天生产的E. coli DNA Ligase，即大肠杆菌DNA连接酶，由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的重组酶。E. coli DNA Ligase是一种以NAD⁺ (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)为辅酶，Mg²⁺依赖的，催化双链DNA中5'磷酸和3'羟基之间形成磷酸二酯键，即催化双链DNA粘性末端连接或双链DNA中的缺刻修复的DNA连接酶[1]。

E. coli DNA Ligase可催化双链DNA相邻粘性末端5'磷酸和3'羟基磷酸二酯键的形成，但常规条件下不能进行平末端双链DNA的连接。在添加10-15% PEG和适当高浓度的单价阳离子时，也可以催化平末端双链DNA的连接反应。E. coli DNA Ligase在一定温度范围内(4-37℃)均具有活性，同时可以被热失活(65℃孵育20分钟)。

碧云天生产的E. coli DNA Ligase连接粘性末端双链线性DNA的效果请参考图1：

图1. 碧云天生产的E. coli DNA Ligase连接粘性末端双链线性DNA的效果图。利用碧云天生产的BeyoFusion™ DNA Polymerase (D7220)，使用两端带有Hind III酶切位点的引物对靶基因进行PCR扩增，生成两种不同长度的两端带有HindⅢ酶切位点的平末端双链线性DNA分子(900bp和600bp)，随后使用碧云天Hind III (D6389)对PCR产物进行酶切，获得两端带有互补粘性末端的双链线性DNA分子，分别作为Substrate 1 (900bp)和Substrate 2 (600bp)；在20µl反应体系(30mM Tris-HCl, 4mM MgCl₂, 1mM DTT, 26μM NAD, 50μg/ml BSA, PH8.0 @25℃)中，分别加入400ng经PCR扩增及Hind III酶切产生的两种双链DNA片段，以及图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的E. coli DNA Ligase，16℃孵育30分钟进行连接，然后65℃孵育20分钟以终止反应。取出10μl反应产物，加入2μl 6X DNA Loading Buffer (D0071)，然后进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有相当的连接粘性末端双链线性DNA的效果。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。

用途：粘性末端双链DNA分子的连接；双链DNA的缺刻修复；cDNA第二链合成后的克隆[2]。

来源：纯化自携带编码E. coli DNA ligase的E. coli重组菌株。

活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of λ DNA (5' DNA termini concentration of 0.12μM, 300μg/ml) in a total reaction volume of 20μl in 30 minutes at 16℃ in 1X E. coli DNA Ligase Reaction Buffer。

纯度：不含除E. coli DNA Ligase之外的其它种类的DNA连接酶，不含内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。

酶储存液：10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 200µg/ml BSA, 50% Glycerol (pH7.4 @25℃)。

10X Reaction Buffer: 300mM Tris-HCl, 40mM MgCl₂, 260μM NAD, 10mM DTT, 500μg/ml BSA (pH8.0 @25℃)。

失活或抑制：65℃孵育20分钟可使E. coli DNA Ligase失活。

-20℃保存，两年有效。10X Reaction Buffer建议长期保存于-80℃，以延长NAD半衰期。

E. coli DNA Ligase需要以NAD (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) 作为辅酶，而不是像T4 DNA连接酶等以ATP为辅酶。

E. coli DNA Ligase对于平末端片段的连接效率是极低的，对于平末端的连接建议使用T4 DNA Ligase。

E. coli DNA Ligase的催化底物是双链DNA分子，不能用于单链DNA或RNA的连接反应。

E. coli DNA Ligase连接反应需要以NAD作为辅助因子，10X Reaction Buffer中含有辅助因子NAD，因此10X Reaction Buffer建议长期保存于-80℃，以延长NAD半衰期。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。