碧云天生产的Quick Blunting Kit，即快速平端化试剂盒，也称Quick Blunting Kit for Blunt-end Ligation，即平端连接用快速平端化试剂盒，或End Repair Kit for Blunt-end Ligation，即平端连接用末端修复试剂盒，是一种通过一次反应将双链DNA快速转变为可以用于后续的平末端连接反应的试剂盒。本试剂盒可以将含有5'或3'突出(5'- or 3'-overhang)的双链DNA转变为带有5'磷酸和3'羟基的平末端双链DNA，以便于有效地与平末端载体或接头进行连接反应。

本试剂盒提供的Blunting Enzyme Mix (平端化酶混合液)中含有的T4 DNA Polymerase (D7052)同时具有3'→5'外切酶活性和5'→3'聚合酶活性，可把双链DNA的末端切平和补平并形成平末端。本试剂盒提供的平端化酶混合液中的T4 Polynucleotide Kinase (D7098)，可将平末端双链DNA的5'磷酸化，并且可以通过其3'磷酸酯酶活性将3'磷酸催化转变为3'羟基，确保可用于与后续载体或接头进行连接反应。

本试剂盒经过优化，单次反应可以使5µg的DNA平端化、5'磷酸化和3'羟基化。本试剂盒催化的反应请参考图1。

图1. 碧云天生产的Quick Blunting Kit催化的双链DNA的平端化反应示意图。本试剂盒可以催化5'突出的补平(聚合酶反应)、3'突出的切平(3'外切酶反应)、5'羟基的磷酸化(5'多聚核苷酸激酶反应)和3'磷酸转变为3'羟基(3'磷酸酯酶反应)共4个常见的反应。蓝色和绿色分别代表不同的DNA序列。

碧云天生产的Quick Blunting Kit平齐化/磷酸化DNA的效果请参考图2。

图2. 碧云天生产的Quick Blunting Kit平齐化和磷酸化DNA的效果图。1. 未加入Blunting Enzyme Mix；2. 用碧云天的Quick Blunting Kit进行平端化和磷酸化反应；3. 以碧云天的Quick Blunting Kit催化的平端化和磷酸化反应产物为底物，用快速DNA连接试剂盒(D7002)进行连接；4. 用Competitor (N公司)的Quick Blunting Kit进行平齐化和磷酸化反应；5. 以N公司的Quick Blunting Kit催化的平端化和磷酸化反应产物为底物，用快速DNA连接试剂盒(D7002)进行连接。平端化和磷酸化反应体系(25μl)：0.8μM dsDNA, 1X Blunting Buffer, 0.1mM dNTP mix, 1μl Blunting Enzyme Mix, 25℃孵育15min，70℃孵育10min进行失活；随后取出2μl反应液，用Nuclease-Free Water补足至5μl，加入1μl 6X DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后用NA-Red (EB升级换代产品, 2000X) (D0128)室温染色15min，使用凝胶成像设备观察实验结果。连接反应体系(20μl)：8μl待连片段，1X Rapid Ligation Buffer, 2μl Rapid T4 DNA ligase，25℃孵育15min，65℃孵育10min进行失活；随后取出5μl反应液，加入1μl 6X DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用NA-Red (EB升级换代产品, 2000X) (D0128)室温染色15min，使用凝胶成像设备观察实验结果。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有类似的催化效果。dsDNA是由DNA Template和Primer按照D0251产品说明书中推荐的程序进行退火反应得到的产物，Template: 5'-OH-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-OH-3', Primer: 5'-OH-GTAAAACGACGGCCAGT-OH-3'。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

Quick Blunting Kit，即快速平端化试剂盒，也称快速平末端化试剂盒、快速末端平滑试剂盒、快速末端平滑化试剂盒、快速末端平齐化试剂盒，也称End Repair Kit for Blunt-end Ligation或End Repair Kit for Blunt-end DNA Ligation，即平端连接用末端修复试剂盒、平端连接用DNA末端修复试剂盒。

用途：对酶切、机械打断等片段化的DNA进行平端化处理，以便于与质粒、cosmid、fosmid或BAC载体、以及二代测序的DNA adaptor等进行连接；PCR产物、cDNA等进行平端化以便于进行平末端克隆或高通量测序接头连接。

本试剂盒的反应体系为25μl时，小包装和中包装可分别使用20和100次。

-20℃保存，至少一年有效。

PCR产物需要适当纯化后再用本产品进行平端化和5'磷酸化。

限制性内切酶消化产生的DNA很多情况下可以不经过纯化步骤，直接进行平端化、5'磷酸化和3'去磷酸化反应。虽然反应效率可能会有一定差异，但不会影响平端克隆。如果用于高通量测序建库，需要酌情考虑是否需要纯化后再进行后续反应。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。