碧云天生产的QuickMutation™Plus基因定点突变试剂盒(QuickMutation™Plus Site-Directed Mutagenesis Kit)可以快速完成质粒特别是超大质粒(10-35kb)的点突变(point mutation)、多个邻近密码子的突变、单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)突变。

基因定点突变常用于研究基因的转录调控、RNA或蛋白质的结构和功能，以及用于质粒中部分序列的微调等。

本试剂盒利用了目前最常用的基因点突变技术，只需通过基于PCR的突变质粒的生成，和基于DpnI的模板质粒的消化，转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图1)。DpnI消化仅需5分钟，累计操作时间约2-3小时即可完成基因的定点突变。

图1.基因定点突变试剂盒原理图

本试剂盒使用了最新的保真性更强，灵敏度更高，扩增速度可达2kb/min，扩增长度可达35kb的BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase，从而大大缩短了突变反应所需的时间，进一步提高了基因定点突变的成功率。同时进一步严格验证了试剂盒中的DpnI，确保能在5分钟内充分消化掉甲基化的模板质粒，同时不会消化未甲基化的PCR产物。

参考图1，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为25-45个碱基互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于DH5α等dam⁺大肠杆菌，在这些dam⁺细菌中质粒会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。随后把DpnI处理过的产物转化感受态细菌后，突变质粒中的两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。

本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。

经检测，本试剂盒可对长达14kb的模板质粒完成定点突变PCR扩增(图2):

图2. 使用本试剂盒对pcDNA3.1-SRCAP(14566bp)质粒进行点突变时的PCR及PCR酶切后的电泳效果图。图A. pcDNA3.1-SRCAP质粒大小的酶切鉴定电泳图。XbaI酶切后产生两条带，一条带为9173bp, 另一条带为5393bp。图B. pcDNA3.1-SRCAP点突变PCR后DpnI消化前后的质粒电泳图。1. DNA ladder (D0110)；2. DpnI消化前的PCR产物，3. DpnI消化后的PCR产物。

本试剂盒使用pcDNA3.1-SRCAP(14566bp)质粒进行了点突变测试，实测突变率接近100%(参考图3)。实际进行点突变时，可能会因为突变引物的设计、模板使用量、感受态效率等因素出现不同的突变率。

图3. 本试剂盒对pcDNA3.1-SRCAP(14566bp)质粒进行点突变的实际效果图。A. 使用本试剂盒进行点突变获得的LB平板照片。以pcDNA3.1-SRCAP质粒为模板，使用本试剂盒进行PCR扩增以实现点突变，DpnI 37℃消化5min，取10µl产物转化100µl DH5α感受态，涂板后37℃培养过夜所获得的LB平板照片。B. 阴性对照LB平板照片。与A相比没有添加BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase，这样模板质粒完全被DpnI酶所消化，没有任何的假阳性克隆产生。C. 突变前后的测序图。突变前的测序结果(WT, wild type)和从图A中挑取9个克隆的测序结果(Mu, mutant)。箭头所示为拟突变的两个位点，红色下划线的为突变前和突变后的碱基。本次实验的突变率达到了100%。

本试剂盒小包装D0208S和中包装D0208M分别可以进行十次和五十次基因定点突变反应。

-20℃保存，一年有效。

需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。

需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。需自备用于细菌转化的试剂。

使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。