碧云天生产的BeyoCRISPR™ Two-Step sgRNA Synthesis Kit，即BeyoCRISPR™两步法sgRNA合成试剂盒，是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术而研发的sgRNA (single guide RNA)体外转录合成试剂盒。使用本试剂盒，用户仅需按照本试剂盒说明书设计并合成Target-specific DNA oligo，就可以通过本试剂盒每次反应获得10-40μg sgRNA。获得的sgRNA可以用于体外分析和鉴定sgRNA的效果，也可以用于转染表达Cas9的细胞以实现目的基因的基因编辑。

CRISPR/Cas9是一项突破性的基因组编辑技术，操作便捷，应用广泛。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一种原核生物利用RNA引导的DNA核酸酶Cas9对外源的噬菌体或病毒核酸进行基因沉默的获得性免疫系统(adaptive immune system)，后续在此基础上逐渐发展为广泛应用于原核和真核生物的越来越成熟的基因编辑技术。该技术能够在sgRNA引导下通过Cas9对原核和真核生物的基因组DNA的靶向序列进行位点特异性的切割，然后通过易错修复(error-prone repair)或同源重组(homologous recombination)在切割位点改变或插入序列来产生移码突变，从而通过基因编辑而实现基因敲除。其中sgRNA确保识别位点的特异性。随着CRISPR技术的发展，该技术目前不仅可以实现基因敲除，还可以实现基因的点突变、插入突变等多种突变方式，特别是在临床应用方面可以用于修复不良突变等[1, 2]。同时通过构建没有内切酶活性的Cas9突变体dCas9，通过与dCas9直接融合表达或间接招募转录激活或转录抑制因子，可以实现sgRNA靶向基因的转录激活或转录抑制。

sgRNA，也称gRNA，由18-20bp与靶基因序列互补的CRISPR RNA (crRNA)序列以及能与Cas9特异性结合的trans-activating crRNA (tracrRNA)序列组成。在细胞内，Cas9核酸酶可以特异性地结合sgRNA，同时sgRNA也能特异性地与相应的靶基因序列配对结合，这样就可以导致Cas9核酸酶在靶基因位点的PAM (proto-spacer adjacent motif)序列NGG上游大约三个碱基的位置对靶基因进行切割。随后在细胞DNA修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换，从而可能产生移码突变，导致目的基因的缺失突变[1]。

碧云天生产的BeyoCRISPR™ Two-Step sgRNA Synthesis Kit通过PCR扩增和依赖于T7 RNA聚合酶的转录两步法高效产生靶向目的基因的sgRNA。本试剂盒提供了预混合的Scaffold Template，Scaffold Template包括与使用者设计的目标特异性序列部分重叠的长度为80nt序列以及用于扩增该序列的引物，退火形成互补链后由DNA聚合酶进行聚合，并最终生成用于转录的双链DNA模板。利用本试剂盒提供的试剂和使用者自己设计的特异性DNA序列，单管反应可在0.5h-4h内获得10-40μg功能性的sgRNA。纯化后的sgRNA可以转染细胞，在表达Cas9的细胞中进行基因编辑，也可以与Cas9核酸酶混合进行酶切鉴定实验。

本试剂盒通过两步法合成sgRNA的原理请参考图1。其中第一步通过PCR反应扩增获得用于RNA转录的模板DNA，第二步通过RNA聚合酶合成sgRNA。

图1. 碧云天生产的BeyoCRISPR™ Two-Step sgRNA Synthesis Kit (D7083)合成sgRNA的原理图。

碧云天生产的BeyoCRISPR™ One-Step sgRNA Synthesis Kit (D7081)和BeyoCRISPR™ Two-Step sgRNA Synthesis Kit (D7083)的主要差别在于一步法操作简单仅需一步反应，但产量仅为两步法的约一半；两步法操作略复杂，但每个反应的产量比一步法多约1倍。

碧云天生产的BeyoCRISPR™ Two-Step sgRNA Synthesis Kit合成sgRNA的效果请参考图2。

图2. 碧云天生产的BeyoCRISPR™ Two-Step sgRNA Synthesis Kit (D7083)合成sgRNA的效果图。参考本试剂盒的使用说明设置20μl PCR反应体系并进行PCR反应。参考本试剂盒的使用说明，设置20μl转录反应体系，37℃分别孵育0.5h, 1h, 2h, 4h，70℃孵育10min以终止反应。取出5μl反应液，加入1μl DNA上样缓冲液(6X) (D0071)作为模板消化前的样品；另外取出5μl反应液，加入1μl DNase I，37℃孵育15min以消化DNA模板，加入1μl DNA上样缓冲液(6X) (D0071)作为消化模板后的样品。将模板消化前后的样品进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后使用D0130 NA-Red (EB升级换代产品)室温染色15min，使用凝胶成像系统观察实验结果。如图所示，使用本试剂盒可以很好地合成sgRNA，并且在图中所示的反应时间内，反应时间越长，合成的sgRNA的产量越高。不同实验条件产生的效果可能有所不同，图中效果仅供参考。

碧云天生产的BeyoCRISPR™ Two-Step sgRNA Synthesis Kit合成的sgRNA引导Cas9核酸酶切割目的序列的效果请参考图3。

图3. 碧云天生产的BeyoCRISPR™ Two-Step sgRNA Synthesis Kit (D7083)合成的sgRNA引导Cas9核酸酶切割目的基因的效果图。设置27μl反应体系，其中包含1X Cas9 Reaction Buffer, 30nM sgRNA, 30nM Cas9 Nuclease (SpCas9) (D0511)，25℃孵育10min使sgRNA与Cas9 Nuclease充分结合。随后加入3μl底物DNA (3nM final)，混合均匀，37℃孵育15min进行切割反应。随后加入1μl Proteinase K (Proteinase K, ST533)，混合均匀，室温孵育10min以降解反应体系中的蛋白酶。取出10μl反应液，加入2μl DNA上样缓冲液(6X) (D0071)进行琼脂糖凝胶(1.5%)电泳，电泳结束后使用D0130 NA-Red (EB升级换代产品)室温染色15min，并使用凝胶成像系统观察实验结果。泳道1：反应体系中没有加入sgRNA，DNA片段大小为2773bp；泳道2：反应体系中加入了sgRNA，切割产生的DNA片段大小分别为2206bp和567bp。如图所示，使用本试剂盒合成的sgRNA可以有效引导Cas9 Nuclease充分切割目的DNA。不同实验条件产生的效果可能有所不同，图中效果仅供参考。

-20℃保存，至少一年有效。

酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

严格使用RNase Free的实验器材(如吸头、离心管、PCR管等)，并在操作过程中严格注意避免RNase污染。

需要自备的主要试剂：3M NaAc (pH5.2)；无水乙醇；70%乙醇；1:1水饱和苯酚/氯仿混合溶液。如需更多的Ultrapure Water，推荐选购碧云天的ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。