碧云天研发的基质金属蛋白酶3 (MMP-3)活性荧光检测试剂盒(MMP-3 Activity Fluorometric Assay Kit, or MMP-3 Activity Assay Kit (Fluorometric))，是一种用荧光法快速高灵敏检测细胞、组织或血液等样品中基质金属蛋白酶3 (Matrix Metalloproteinase-3, MMP-3)活性的试剂盒。

基质金属蛋白酶3 (MMP-3，也称MMP3)又称基质分解素1 (stromelysin-1)，是MMP家族的重要成员之一，分子量约为57kDa。依据结构特点，MMP-3可分为3个结构域。(1)氨基端分泌信号肽和前体肽结构域，由分泌信号肽(约17aa)和前体肽(约80aa)组成。新翻译形成的全长MMP-3称为pre-pro-MMP-3，分泌信号肽可引导新合成的pre-pro-MMP-3分泌到细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，同时在分泌过程中信号肽被剪切去除而形成MMP-3前体 (pro-MMP-3)。而前体肽中的“半胱氨酸开关”序列中的半胱氨酸与Zn²⁺协同作用，可以保持pro-MMP-3处于非激活形式。MMP-3前体被纤溶酶(plasmin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)等丝氨酸蛋白水解酶(serine protease)剪切去除包含半胱氨酸开关的前体肽，就会被激活形成具有蛋白酶活性的MMP-3。(2)氨基端催化结构域，其中包含一个保守的Zn²⁺结合位点，为整个蛋白酶的活性部位。(3)羧基端结构域，该结构域的氨基酸序列与血红素结合蛋白相似，是MMP-3与底物相结合的部位。MMP-3能够降解或剪切多种细胞外基质成分、前体蛋白或前体酶等，具体包括Collagen α-chains, Aggrecan, Laminin, Fibronectin, Elastin, Casein, α-1 Antitrypsin, Myelin Basic Protein, IL-1 β, IGFBP-3, pro-MMP-1, pro-MMP-7, pro-MMP-8, pro-MMP-9, pro-MMP-13等，能破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障、释放E-钙粘蛋白(E-cadherin)、促进肿瘤侵袭转移、促进炎症反应，在肿瘤等的研究中日益受到重视。此外，MMP-3还参与组织形态发生、损伤修复、炎症反应等一系列生理、病理过程，在风湿性关节炎、动脉粥样硬化等疾病发生发展过程中发挥重要作用。

本MMP-3活性荧光检测试剂盒采用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其检测原理如下。MCA是荧光供体(Donor)，Dnp是荧光受体(Acceptor)或称为淬灭基团(Quencher)，供体的发射光谱和受体的激发光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般7-10nm)，荧光能量由供体向受体转移，导致供体荧光分子的荧光强度衰减。MCA和Dnp被连接到MMP-3酶的天然底物上的两端，当MMP-3蛋白酶没有切割该底物时，两个基团足够接近，发生荧光共振能量转移，即Dnp可淬灭MCA的荧光而导致检测不到荧光；当该底物被MMP-3蛋白酶切割后，多肽的首尾两端分离，两个基团分开，MCA的荧光不再被Dnp淬灭，即可检测到MCA的荧光，这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测MMP-3蛋白酶的酶活性。MCA的最大激发波长为325nm，最大发射波长为393nm。

图1. 基质金属蛋白酶3(MMP-3)活性荧光检测试剂盒检测MMP-3活性的原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。96孔板中，本试剂盒最少可以检测到20µU的MMP-3活性，通常1-10μl细胞或组织样品足够用于本试剂盒的荧光法检测。

本试剂盒特异性强。本试剂盒使用的底物为NFF-3的相应肽段序列，可非常快速地被MMP-3切割(kcat/Km=218,000s^-1×M^-1)，而对于MMP-9则较慢(kcat/Km=10,100s^-1×M^-1)，几乎不会被MMP-1或MMP-2识别而切割，所以NFF-3肽段序列作为底物可以特异性地用于MMP-3活性的检测而区分于其它基质金属蛋白酶。

本试剂盒适用范围广，使用灵活，检测速度快，通用性好。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆以及肝脏等组织或细胞样品的检测，不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(high-throughput screening)的自动化操作系统，灵活性强。本试剂盒使用胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)对MMP-3前体进行激活，激活时间仅需要5分钟，而其它试剂盒使用APMA激活方式的一般需要约24小时的激活时间。本试剂盒通用性好，经测试，不仅本试剂盒提供的MMP-3检测缓冲液处理的样品，常规的蛋白裂解液处理的样品也可以用本试剂盒的检测，并且提供了纯化的MMP-3酶作为阳性对照，便于检测体系的建立和确认。

本试剂盒可以进行MMP-3的绝对活性检测。本试剂盒提供了MCA标准溶液，可以通过设置标准曲线，计算出样品中的MMP-3绝对活性。

对于96孔板，本试剂盒的小包装P0338S可以进行100次检测，中包装P0338M可以进行500次检测。

-20℃保存，一年有效。其中P0338-6 Substrate需避光保存。

Assay Buffer、MCA Standard (10mM) 和Substrate需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。MMP-3 Positive Control (10X)和α-Chymotrypsin使用时应置于冰上，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。

体积较小的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。

如果使用本试剂盒提供的Assay Buffer制备样品，并且加入的样品量在本试剂盒的推荐范围内，可以确保反应体系的pH值在适宜的范围内。如果使用自行配制的裂解液，请确保加入样品后反应体系的pH值在7.5-8.0之间，或者确保样品的pH值在7.5-8.0之间，否则可能会影响检测结果的信号值和稳定性。

样品经α-Chymotrypsin预处理后检测的是样品中的总MMP-3 (包括无活性的MMP-3前体和激活的MMP-3)，如果只需要检测样品中的已激活的MMP-3活性则不需要使用α-Chymotrypsin进行预处理。

样品中如果有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等蛋白酶，可能会对酶活性的检测产生一定的影响，可加入试剂盒提供的广谱的丝氨酸蛋白酶抑制剂Serine Proteinase Inhibitor进行抑制。本试剂盒中提供的α-Chymotrypsin和Serine Proteinase Inhibitor的使用量经过优化，不会对酶活性的检测产生显著影响。

样品和MMP-3 Positive Control首次经α-Chymotrypsin激活后，可在-20℃储存，后续可直接使用，无需再次激活，且反复冻融5次对激活后的MMP-3酶活性基本无影响。

EDTA等金属螯合剂，对MMP-3酶活性有影响，处理样品时应避免EDTA等螯合剂的加入。

检测时建议使用96孔黑板，推荐选购碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)。

血清、血浆等样品如果置于4℃保存，保存的时间不应超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20℃保存，-80℃保存更佳。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。