碧云天研发的基质金属蛋白酶3 (MMP-3)抑制剂筛选试剂盒(MMP-3 Inhibitor Screening Kit)是一种用荧光法简单、快速、高通量、高灵敏地筛选基质金属蛋白酶3 (Matrix Metalloproteinase-3, MMP-3)抑制剂的试剂盒。

基质金属蛋白酶3 (MMP-3，也称MMP3)又称基质分解素1 (stromelysin-1)，是MMP家族的重要成员之一，分子量约为57kDa。依据结构特点，MMP-3可分为3个结构域。(1)氨基端分泌信号肽和前体肽结构域，由分泌信号肽(约17aa)和前体肽(约80aa)组成。新翻译形成的全长MMP-3称为pre-pro-MMP-3，分泌信号肽可引导新合成的pre-pro-MMP-3分泌到细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，同时在分泌过程中信号肽被剪切去除而形成MMP-3前体 (pro-MMP-3)。而前体肽中的“半胱氨酸开关”序列中的半胱氨酸与Zn²⁺协同作用，可以保持pro-MMP-3处于非激活形式。MMP-3前体被纤溶酶(plasmin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)等丝氨酸蛋白水解酶(serine protease)剪切去除包含半胱氨酸开关的前体肽，就会被激活形成具有蛋白酶活性的MMP-3。(2)氨基端催化结构域，其中包含一个保守的Zn²⁺结合位点，为整个蛋白酶的活性部位。(3)羧基端结构域，该结构域的氨基酸序列与血红素结合蛋白相似，是MMP-3与底物相结合的部位。MMP-3能够降解或剪切多种细胞外基质成分、前体蛋白或前体酶等，具体包括Collagen α-chains, Aggrecan, Laminin, Fibronectin, Elastin, Casein, α-1 Antitrypsin, Myelin Basic Protein, IL-1 β, IGFBP-3, pro-MMP-1, pro-MMP-7, pro-MMP-8, pro-MMP-9, pro-MMP-13等，能破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障、释放E-钙粘蛋白(E-cadherin)、促进肿瘤侵袭转移、促进炎症反应，在肿瘤等的研究中日益受到重视。此外，MMP-3还参与组织形态发生、损伤修复、炎症反应等一系列生理、病理过程，在风湿性关节炎、动脉粥样硬化等疾病发生发展过程中发挥重要作用。

本MMP-3抑制剂筛选试剂盒采用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其检测原理如下。MCA是荧光供体(Donor)，Dnp是荧光受体(Acceptor)或称为淬灭基团(Quencher)，供体的发射光谱和受体的激发光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般7-10nm)，荧光能量由供体向受体转移，导致供体荧光分子的荧光强度衰减。MCA和Dnp被连接到MMP-3酶的天然底物上的两端，当MMP-3蛋白酶没有切割该底物时，两个基团足够接近，发生荧光共振能量转移，即Dnp可淬灭MCA的荧光而导致检测不到荧光；当该底物被MMP-3蛋白酶切割后，多肽的首尾两端分离，两个基团分开，MCA的荧光不再被Dnp淬灭，即可检测到MCA的荧光，这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测MMP-3蛋白酶的酶活性。如果在反应体系中加入MMP-3蛋白酶的抑制剂(Inhibitor)，荧光的生成会被抑制，荧光强度与抑制剂的抑制效果成反比，这样就可以检测出MMP-3蛋白酶抑制剂的抑制效果。MCA的最大激发波长为325nm，最大发射波长为393nm。

图1. 基质金属蛋白酶3 (MMP-3)抑制剂筛选试剂盒检测原理图。

本试剂盒抑制剂筛选结果真实可信。本试剂盒中使用的全长重组人MMP-3蛋白是碧云天采用自主研发的PerfectProtein™哺乳动物蛋白表达技术平台纯化而来，并已预先激活，酶活性好。本试剂盒中使用的底物特异性好，使用的底物为NFF-3的相应肽段序列，可非常快速地被MMP-3切割(kcat/Km=218,000s^-1×M^-1)，而对于MMP-9则较慢(kcat/Km=10,100s^-1×M^-1)，几乎不会被MMP-1或MMP-2识别而切割，所以NFF-3肽段序列作为底物可以特异性地用于MMP-3活性的检测而区分于其它基质金属蛋白酶。因此本试剂盒用于MMP-3抑制剂筛选时，筛选获得的抑制剂更加真实可信。

本试剂盒稳定性好，检测效果佳。孵育1小时，100%酶活性信号约为背景信号的5-7倍，确保有足够的信号范围用于抑制剂的筛选。通常在孵育1小时内，信号与孵育时间成正比，1小时后即趋于稳定。

本试剂盒中提供了MMP-3酶(MMP-3 Enzyme)、底物(Substrate)、阳性对照抑制剂(GM6001)，并且对MMP-3酶和底物的使用量进行了优化，不仅能检测出IC₅₀很低的抑制剂，也能检测出IC₅₀较高的抑制剂。本试剂盒提供的阳性对照GM6001(别名Galardin或Ilomastat ) (SF4180)是一种广谱基质金属蛋白酶抑制剂，作用于MMP-3、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-12、MMP-14和MMP-26，Ki分别为27nM、0.4nM、0.5nM、3.7nM、0.1nM、0.2nM、3.6nM、13.4nM和0.36nM。在本试剂盒中GM6001的IC₅₀约为60nM，实测数据会略有偏差。

对于96孔板，本试剂盒小包装P0339S可以进行100次检测，中包装P0339M可以进行500次检测。

-20℃保存，一年有效。其中Substrate须避光保存。

Assay Buffer、Substrate、GM6001 (0.1mM)需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。MMP-3 Enzyme使用时应置于冰上，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。

体积较小的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。

确保加入样品后反应体系的pH值在7-8之间，或确保样品的pH值在7-8之间，否则可能会影响检测结果的信号值和稳定性。

待测抑制剂样品的溶剂可能会对检测产生干扰，推荐使用本试剂盒提供的Assay Buffer作为溶剂用于配制、稀释样品。如果样品必须用其它试剂配制、稀释，请进行一定的测试，并在对照孔中添加与样品等体积的溶剂以排除干扰。经测试，反应体系中DMSO、无水乙醇、甘油浓度达5%时对检测结果没有影响，但仍然建议进行一定的预实验并尽量降低DMSO、无水乙醇、甘油等溶剂在反应体系中的浓度。

尽管经测试本试剂盒中的MMP-3 Enzyme反复冻融5次对活性基本没影响，为取得良好的检测效果，建议第一次使用时适当分装保存。

EDTA等金属螯合剂，对MMP-3酶活性有影响，应避免EDTA等螯合剂的加入。

检测时建议使用96孔黑板，推荐选购碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。