Lenti-mCherry-EGFP-LC3B，即Lentivirus expressing mCherry-EGFP-LC3B fusion protein，是一种可以表达mCherry-EGFP-LC3B融合蛋白的慢病毒，可以用于感染细胞或组织后进行细胞自噬(autophagy)检测。本产品带有嘌呤霉素(puromycin)抗性，感染细胞后可以筛选稳定株以用于后续的自噬研究。

自噬(autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。自噬与多种生理功能有关，在饥饿等环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域的一个新的研究热点。

LC3是酵母自噬关键蛋白ATG8在哺乳动物中的同源蛋白。LC3最初被分析鉴定为microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3)。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亚家族，其中对于LC3B的研究最为广泛。到目前为止，LC3B 被认为是细胞自噬信号通路最为关键的标志性蛋白。LC3B是一个具有125个氨基酸残基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22个氨基酸蛋白，从而暴露出C端的甘氨酸，人们把它命名为胞质形式的LC3B I。在细胞自噬的过程中，其C端暴露的甘氨酸经过一个类似泛素化的过程，以ATG7为E1样激活酶(E1-like activating enzyme)，以ATG3为E2样连接酶(E2-like conjugation enzyme)，以Atg12-Atg5-Atg16复合物为E3样连接酶(E3-like ligase)，在C端甘氨酸上共价连接上磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)而成为LC3B-PE即LC3B II。与胞质定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬体 (autophagosome)的内膜和外膜上。在自噬体与溶酶体融合后，自噬体外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬体内膜上的 LC3B II则被溶酶体内的蛋白酶所降解。尽管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其极强的疏水性，在SDS-PAGE电泳时，LC3B II比LC3B I迁移得更快，其表观分子量分别为14kD和16kD。

Lenti-mCherry-EGFP-LC3B是碧云天自行研发的重组慢病毒，感染后能够在靶细胞中有效表达红色荧光蛋白(mCherry)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和LC3B的融合蛋白，呈现明亮的红色和绿色荧光，可以用于细胞自噬的检测。本产品感染HEK293T细胞的效果如图1所示。

图1. Lenti-mCherry-EGFP-LC3B感染HEK293T细胞的效果图。96孔板每孔10,000个细胞，培养过夜后用相应的病毒TU数进行感染，病毒感染72h后荧光显微镜实拍相同视野效果图。实际检测效果会因检测仪器、实验条件的不同而存在差异，本图仅供参考。

自噬小体在与溶酶体融合过程中，溶酶体内的酸性环境会导致EGFP荧光淬灭，这为追踪EGFP-LC3B的细胞定位增加了难度。mCherry是一种来自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的单体红色荧光蛋白，当其与EGFP进行LC3B的共同标记时，在EGFP被溶酶体酸性环境所淬灭的情况下，可以发出红色荧光的mCherry因为其卓越的稳定性而被保留。因此，通过融合表达mCherry-EGFP-LC3B蛋白，可以非常有效地追踪自噬过程。在用Lenti-mCherry-EGFP-LC3B慢病毒感染细胞后，在非自噬的情况下，荧光显微镜下mCherry-EGFP-LC3B以弥散的黄色荧光(mCherry和EGFP的综合效果)形式存在于细胞质中;而在自噬的情况下，荧光显微镜下mCherry-EGFP-LC3B则聚集在自噬体膜上，以黄色斑点的形式表现出来(LC3B dot or punctae)；当自噬体与溶酶体融合后，因EGFP荧光的部分淬灭而以红色斑点的形式表现出来。

慢病毒感染细胞后会将目的基因随机整合到基因组DNA上，因而可以长期稳定地表达目的蛋白，并且几乎可以感染所有哺乳动物细胞，在很多不分裂的细胞中也可以长期稳定表达，广泛应用于细胞和动物实验。

本产品表达嘌呤霉素抗性基因，因此本产品感染培养的细胞后可以使用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞株以用于后续研究。

碧云天的Lenti-mCherry-EGFP-LC3B是复制缺陷型。其3’ LTR的增强子功能发生缺失，形成了自失活(self-inactivating) 3’ LTR，并且5’ LRT中的U3区域替换成CMV启动子，在感染普通的细胞后不能进行复制和扩增，从而有效降低了本产品在活体生物中的风险。

碧云天推荐的慢病毒感染不同种类体外培养细胞的MOI值参见下表。

实验室常用的逆转录病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、腺相关病毒(AAV)和腺病毒(Adenovirus)的主要特征之间的比较和差别参见下表。具体的特定病毒的一些特征和下表相比可能会有一定差异。

碧云天提供慢病毒、腺病毒和腺相关病毒三种类型用于自噬检测的产品：Lenti-mCherry-EGFP-LC3B (C3002)、Lenti-EGFP-LC3B (C3003)、Ad-mCherry-GFP-LC3B (C3011)和AdPlus-mCherry-GFP-LC3B (C3012)、AAV-mCherry-GFP-LC3B (C3013)。Lenti-mCherry-EGFP-LC3B (C3002)和Lenti-EGFP-LC3B (C3003)适合用于一些腺病毒较难感染或者需要筛选稳定细胞株的情况；Ad-mCherry-GFP-LC3B (C3011)和AdPlus-mCherry-GFP-LC3B (C3012)由于表达起始时间短，适合用于能被腺病毒感染并且希望快速获得实验结果的情况，也可以在表达E1的HEK293A、HEK293等适当细胞中扩增，便于后续长期使用；AAV-mCherry-GFP-LC3B (C3013)由于其组织特异性和低免疫原性更适合用于动物实验。四种产品的比较和选择请参见下表。

本产品的滴度为10^9TU/ml，适合细胞实验或活体动物实验。TU, transduction unit，即转导单位。TU通过本产品梯度稀释后感染HEK293T细胞后测定获得，能让一个HEK293细胞呈现绿色荧光的活力单位定义为1TU。MOI (Multiplicity of Infection)是病毒感染细胞时，病毒数量与细胞数量的比值。使用10^9TU/ml的本产品，如果按照5 MOI感染6孔板的细胞，每孔50万细胞计算，100μl共可以感染40个孔；如果按照5 MOI感染24孔板的细胞，每孔10万细胞计算，100μl共可以感染200个孔。如果MOI值提高，那么相应可以感染的孔数会减少；如果MOI值下调，那么相应可以感染的孔数会增加。

-80℃保存，一年有效。-20℃保存，1-2个月内有效。4℃保存，一周内有效。

反复冻融会降低病毒滴度，如有必要请在收到本产品后分装保存。分装时必须在冰浴上进行。病毒融解后，如果在一周内使用，可以放置于4℃，但须注意4℃存放时间越长，滴度下降越明显。如果-80℃保存时间超过一年，可能会导致滴度下降，此时建议重新测定病毒滴度。

本产品使用前请仔细阅读附录1《慢病毒使用安全规范》。本产品生物安全等级为Biosafety Level 2 (BSL-2)，在按照常规的微生物实验操作要求进行操作(Standard microbiological practices)的基础上，还需要注意限制接触、生物危害提示、显著的警示标识、并制定相应的安全规范。

病毒操作中应注意有效防护，绝对禁止在生物安全柜内有任何皮肤直接暴露的情况。实验完成后，请及时清洗双手。严禁直接接触病毒，如意外接触，请及时用清水冲洗，并适当用70%乙醇对皮肤进行消毒。

任何接触过病毒的材料、试剂、样品，应经消毒处理，可以采用1%的SDS溶液、或84消毒液(1:20)浸泡30分钟以上，或121℃高压灭菌30分钟。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。