Lenti-CMV-EGFP-p65-EF1α-Puro，即Lentivirus expressing EGFP-p65 fusion protein and puromycin，是碧云天自行研发的一种可以在大多数哺乳动物细胞(包括原代细胞和干细胞)中通过CMV启动子表达EGFP-p65融合蛋白的重组慢病毒。本产品可用于检测NF-κB信号通路的激活和抑制。本产品主要适合用于通过荧光显微镜等观察NF-κB的核转运激活。本产品带有嘌呤霉素(puromycin)抗性，感染细胞后可以筛选稳定株。

NF-κB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)，中文名为激活的B细胞核因子kappa-轻链增强子，是细胞内重要的核转录因子，参与细胞对外界刺激的响应、炎症反应、免疫应答等过程，几乎存在于所有类型的动物细胞中。NF-κΒ作为转录因子蛋白家族，包括5个亚单位：p50 (NF-κB1)、p52 (NF-κB2)、p65 (REL-associated protein, Rel-A)、Rel-B和c-Rel，它们的N端都具有高度保守的RHD (REL homology domain)；5个亚单位根据C端结构域的不同被分为两类，第一类为p50、p52，其C端具有ankyrin重复结构域具有转录抑制活性(Transrepression activity)和招募IKK (Inhibitory κB kinase)的致死结构域(Dead domain)；第二类为p65、Rel-B和c-Rel，其C端具有转录所必需的转录激活结构域(Transactivation domain, TAD)[1]。

NF-κB在静息状态或失活状态(Resting state or inactive state)下，其高度保守的RHD中的核定位信号(Nuclear localization sequence, NLS)与抑制因子IκB (Inhibitor of NF-κB)结合形成非活性复合物，NF-κB以失活状态存在于细胞质中。虽然IκB蛋白掩盖了p65的NLS信号，但没有掩盖p50的NLS信号，因此静息状态下NF-κB可以持续在细胞核和细胞质之间穿梭(Shuttle)维持很低水平的活性[2]。

NF-κB的激活存在两条途径，即经典途径和非经典途径。经典途径：在受到促炎信号(如炎症细胞因子TNF-α、IL-1、病原体和病毒双链RNA等)的刺激后，使细胞中的IKK复合物被招募并激活，IKK复合物由IKKα和/或IKKβ催化亚基以及NEMO (NF-κB essential modulator，亦称IKKγ)组成，IKK复合物使IκB被磷酸化，磷酸化的IκB随后发生泛素化被蛋白酶体降解，使得NF-κB的核定位信号暴露从而进入细胞核激活靶基因；非经典途径：该途径由NF-κB抑制激酶NIK (NF-κB inhibitory kinase)介导，NIK磷酸化并激活IKK的亚基IKKα，磷酸化的IKKα再使p100磷酸化，导致加工和释放有活性的p52和RelB异源二聚体转移至细胞核并激活靶标基因，这一过程发生在淋巴器官发育期间，淋巴器官负责产生B淋巴细胞和T淋巴细胞[2]。

Lenti-CMV-EGFP-p65-EF1α-Puro感染HEK293T细胞的效果如图1所示。

图1.碧云天Lenti-CMV-EGFP-p65-EF1α-Puro感染HEK293T细胞的效果图。96孔板每孔10,000个细胞，培养过夜后用相应的病毒TU数进行感染，病毒感染72小时后荧光显微镜实拍相同大小视野效果图。静息状态下，细胞质显示明亮的绿色荧光。实际检测效果会因检测仪器、实验条件的不同而存在差异，本图仅供参考。

慢病毒感染细胞后会将目的基因随机整合到基因组DNA上，因而可以长期稳定地表达目的蛋白，并且几乎可以感染所有哺乳动物细胞，在很多不分裂的细胞中也可以长期稳定表达，广泛应用于细胞和动物实验。

本产品表达嘌呤霉素抗性基因，因此本产品感染培养的细胞后可以使用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞株以用于后续研究。

碧云天的Lenti-CMV-EGFP-p65-EF1α-Puro是复制缺陷型慢病毒。其3' LTR的增强子功能发生缺失，形成了自失活(self-inactivating) 3' LTR，并且5' LRT中的U3区域替换成CMV启动子，在感染普通的细胞后不能进行复制和扩增，从而有效降低了本产品在活体生物中的风险。

碧云天推荐的慢病毒感染不同种类体外培养细胞的MOI值参见下表。

实验室常用的逆转录病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、腺相关病毒(AAV)和腺病毒(Adenovirus)的主要特征之间的比较和差别参见下表。具体的特定病毒的一些特征和下表相比可能会有一定差异。

本产品的滴度为10^9TU/ml，适合细胞实验或活体动物实验。TU, transduction unit，即转导单位。TU通过本产品梯度稀释后感染HEK293T细胞后测定获得，能让一个HEK293细胞呈现绿色荧光的活力单位定义为1TU。MOI (Multiplicity of Infection)是病毒感染细胞时，病毒数量与细胞数量的比值。使用10^9TU/ml的本产品，如果按照5 MOI感染6孔板的细胞，每孔50万细胞计算，100μl共可以感染40个孔；如果按照5 MOI感染24孔板的细胞，每孔10万细胞计算，100μl共可以感染200个孔。如果MOI值提高，那么相应可以感染的孔数会减少；如果MOI值下调，那么相应可以感染的孔数会增加。

-80℃保存，一年有效。-20℃保存，1-2个月内有效。4℃保存，一周内有效。

反复冻融会降低病毒滴度，如有必要请在收到本产品后分装保存。分装时必须在冰浴上进行。病毒融解后，如果在一周内使用，可以放置于4℃，但须注意4℃存放时间越长，滴度下降越明显。如果-80℃保存时间超过一年，可能会导致滴度下降，此时建议重新测定病毒滴度。

本产品使用前请仔细阅读附录1《慢病毒使用安全规范》。本产品生物安全等级为Biosafety Level 2 (BSL-2)，在按照常规的微生物实验操作要求进行操作(Standard microbiological practices)的基础上，还需要注意限制接触、生物危害提示、显著的警示标识、并制定相应的安全规范。

病毒操作中应注意有效防护，绝对禁止在生物安全柜内有任何皮肤直接暴露的情况。实验完成后，请及时清洗双手。严禁直接接触病毒，如意外接触，请及时用清水冲洗，并适当用70%乙醇对皮肤进行消毒。

任何接触过病毒的材料、试剂、样品，应经消毒处理，可以采用1%的SDS溶液、或84消毒液(1:20)浸泡30分钟以上，或121℃高压灭菌30分钟。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。