碧云天生产的T4 PNK Kit (T4 Polynucleotide Kinase Kit)，即T4多聚核苷酸激酶试剂盒。本试剂盒基于T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase, T4 PNK)的激酶活性，可用于催化磷酸基团从ATP转移至单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3’磷酸基团的单核苷酸的5’羟基，实现5’端磷酸化修饰；同时可以基于T4 PNK的磷酸酯酶活性，可用于催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸的3’磷酸的脱磷酸基团的反应。

T4 PNK中文名称T4多聚核苷酸激酶，是一种多聚核苷酸5’羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3’磷酸基团的单核苷酸的5’羟基转移[1]。其它NTP也可产生相同的反应：5’-OH + NTP → 5’-P + NDP。这个磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下，T4 Polynucleotide Kinase可以显示出5’磷酸酯酶的活性，催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3’磷酸基团的单核苷酸的5’磷酸基团向ADP的转移形成ATP [2]。其它NTP也可产生相同的反应：5’-P + NDP → 5’-OH + NTP (最适pH为6.4左右)。当ATP和ADP都适量存在时，T4 Polynucleotide Kinase可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3’磷酸基团的单核苷酸的5’磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。其它NTP也可产生相同的反应：5’-P + NTP + NDP → 5’-P + NDP + NTP。T4 Polynucleotide Kinase同时具有3’磷酸酯酶活性，可催化3’磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3’-P → 3’-OH + Pi (最适pH为5.9左右)。T4 Polynucleotide Kinase的激酶活性在N-末端附近，而磷酸酯酶活性在C-末端附近。

碧云天生产的T4 PNK Kit催化线性双链DNA (Linear double-strand DNA)的5’羟基末端磷酸化和3’磷酸末端去磷酸化的示意图请参考图1。

图1. 碧云天生产的T4 PNK Kit催化线性双链DNA的5’羟基末端磷酸化和3’磷酸末端去磷酸化的反应示意图。本试剂盒可以催化5’羟基的磷酸化(5’多聚核苷酸激酶反应)和3’磷酸转变为3’羟基(3’磷酸酯酶反应)共2个常见的反应。蓝色线条部分代表DNA序列。

碧云天生产的T4 PNK Kit催化线性双链DNA (Linear double-strand DNA)的5’羟基末端磷酸化的效果请参考图2。

图2. 碧云天生产的T4 PNK Kit (D7099)催化线性双链DNA的5’羟基末端磷酸化的效果图。25µl反应体系(磷酸化反应)：20pmol 38bp dsDNA, 1X T4 PNK Buffer, 1µl T4 PNK Enzyme，37℃孵育30分钟进行磷酸化反应。Lambda Exonuclease (D7084)能够高效催化5’磷酸化的双链DNA分子的降解，对非磷酸化修饰的双链DNA和单链DNA则几乎不能酶切，Lambda Exonuclease对底物的消化程度越高，说明本试剂盒对dsDNA的磷酸化越完全。20µl反应体系(Lambda Exonuclease消化反应)：3.2pmol磷酸化底物，67mM Glycine-KOH, 2.5mM MgCl₂, 50µg/ml BSA (pH9.4 @25℃), 1.25U Lambda Exonuclease，37℃孵育5分钟或30分钟，70℃孵育10分钟终止反应，加入6X DNA Loading Buffer (D0071)，取6µl进行Native-PAGE (15%)电泳分析，最终进行核酸染色和荧光成像分析。如图所示，本产品对线性双链DNA的5’羟基末端具有良好的磷酸化效果。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

用途：进行寡核苷酸、DNA或RNA的5’末端标记，用作Southern、Northern、EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5’端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；催化3’磷酸化的单核苷酸的5’磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3’末端连接；去除3’端磷酸基团。

本试剂盒的反应体系为25μl时，小包装和中包装可分别使用50和200次。

-20℃保存，至少一年有效。

本试剂盒提供的10X T4 PNK Buffer中已经包含了ATP，无需再额外添加。

PCR产物需要适当纯化后再用本产品进行5’磷酸化。

限制性内切酶消化产生的DNA很多情况下可以不经过纯化步骤，直接进行5’磷酸化和3’去磷酸化反应。虽然反应效率可能会有一定差异，但不会影响平端克隆。如果用于高通量测序建库，需要酌情考虑是否需要纯化后再进行后续反应。

本试剂盒中的buffer可以很好地兼容T4 DNA ligase。如果后续用于T4 DNA ligase的连接反应，无需进行纯化以去除buffer。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。