FnCas12a，也称为Cpf1，是碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种由RNA引导的可编辑DNA的重组核酸内切酶，具有基因编辑效率高，脱靶效率低的优点。FnCas12a来源于Francisella novicida U112， 分子量大约为154kDa。FnCas12a识别含有TTN的PAM序列，并且FnCas12a的切割位点相对远离其识别位点为多次编辑提供了可能性，这些特点使Cas12a与Cas9可以互为补充。只需简单将guide RNA (gRNA)与Cas12a蛋白相结合，由于该gRNA仅含有crRNA，无需trans-activating crRNA (tracrRNA)即可实现基因编辑的目的(图1)。

CRISPR-Cas系统作为原核生物的适应性免疫系统，广泛存在于细菌和古细菌中，能够保护其自身不受外源DNA或RNA的影响，是非常常用的基因编辑工具。完整的CRISPR-Cas系统包括介导识别DNA的CRISPR RNAs (crRNAs)和介导切割DNA的Cas核酸内切酶。

FnCas12a包含约1300个氨基酸，含有RuvC-like结构域，同时具有DNA和RNA内切酶的活性。研究表明，FnCas12a与Cas9由于两者结构的不同导致了其分子机制有所差异[1]。CRISPR-Cas12a系统是由Cas12a和gRNA (crRNA，仅需约40-44个碱基)组成。FnCas12a由gRNA引导至互补链，识别互补链上5'端短的富含T碱基(5'-TTN-3')的PAM (Protospacer adjacent motif)序列，然后FnCas12a中的RuvC核酸内切酶结构域逐个切割互补链和靶链，以产生交错的DNA双链断裂，断裂发生在PAM序列3'端的约第18个碱基处，切割产物为5'端突出4或5个碱基的粘性末端(图1)。而CRISPR-Cas9系统是由Cas9和gRNA (crRNA和tracrRNA两个RNA分子融合而成)组成，Cas9在gRNA的引导下，识别3'端富含G碱基(5'-NGG-3')的PAM序列，并且Cas9需要使用HNH和RuvC两个核酸酶结构域协同切割DNA，断裂通常发生在PAM序列5'端的第3个碱基处，最终产生平末端。

图1.碧云天Cas12a核酸酶序列识别与DNA切割示意图。

基于crRNA效应复合物中的Cas蛋白，CRISPR-Cas系统分为两类。第Ⅰ类CRISPR-Cas系统利用多蛋白效应复合物发挥作用，其可分为3种类型和12种亚型；而第Ⅱ类CRISPR-Cas系统只需用单一的Cas效应蛋白即可对外源核酸序列进行识别和切割，其可分为3种类型和9种亚型。第Ⅱ类CRISPR-Cas系统由于作用机制简单，因此受到广泛关注，其中众所周知的CRISPR-Cas9系统就属于第Ⅱ类2型。本产品与crRNA共同组成了CRISPR-Cas12a系统，该系统则属于第Ⅱ类5型[2]。

FnCas12a (Cpf1)酶的C端融合了核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)，NLS有助于FnCas12a进入细胞后定位至细胞核，从而提高基因编辑的效率。

碧云天生产的FnCas12a (Cpf1)酶活性检测效果参考图2。

图2.碧云天和N公司的Cas12a酶活性检测对比效果图。20μl水、3μl 10X Reaction Buffer、3μl 300nM gRNA (序列为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUGUGUGAAAUUGUUAUCCG)、1μl Cas12a (浓度分别为62.5、125、250、500、1000nM，加入体系后的终浓度为2.08、4.17、8.33、16.67、33.33nM)，在25℃预孵育10min。然后加入3μl 30nM的pUC18质粒DNA形成30μl反应体系，在37℃孵育10min。加入1μl蛋白酶K，室温孵育10min以终止反应。最后加入6μl DNA上样缓冲液(6X) (D0071)，进行电泳检测。gRNA与Cas12a结合后，将引导后者至pUC18的第479bp处产生酶切，超螺旋的pUC18质粒被Cas12a酶切后产生线性化的pUC18，迁移率变慢。如图2所示，本产品与N公司的Cas12a具有相近的酶活性。实际效果会因样品、具体实验条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。

来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为FnCas12a。

用途：可用于基因编辑和基因检测等。线粒体或质粒DNA等双链环形DNA的线性化。

纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。

浓度：1μM (153.7ng/μl )。

酶储存溶液：500mM NaCl, 20mM Sodium acetate, 0.1mM EDTA, 0.1mM TCEP, 50% (v/v) Glycerol, pH6 @25℃。

10X Reaction Buffer: 500mM NaCl, 100mM Tris-HCl, 100mM MgCl₂·6H₂O, 1mg/mL BSA, pH7.9 @25℃。

失活或抑制：65℃加热10分钟失活。

-20℃保存，至少两年有效。

本产品使用过程中需要确保Nuclease-free，操作时应特别小心，避免被污染。所有操作都需要按照RNase-free的要求进行。

对于操作环境中核酸酶的去除，推荐使用碧云天生产的RNase and DNase Away (R0123)以去除实验桌面上或其它接触面上的核酸酶。反应体系中推荐加入RNase Inhibitor以保护RNA不被降解。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。